趨化因子CCL19對(duì)小鼠 認(rèn)知及情緒樣行為的影響

摘要

情緒和認(rèn)知是上等神經(jīng)精神活動(dòng)的重要內(nèi)容，其功能研究是腦科學(xué)研 究的重要部分。免yi系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)中qu神經(jīng)系統(tǒng)的思維活動(dòng)，其機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，其中亦包括免yi細(xì)胞以及免yi分子如細(xì)胞因子等對(duì)中qu神經(jīng)系統(tǒng)功 能的調(diào)節(jié)作用。并且，神經(jīng)精神ji病與免yi系統(tǒng)炎癥密切相關(guān)，可表現(xiàn)為 臨床上常見的中qu神經(jīng)系統(tǒng)ji病與免yi系統(tǒng)的“共病”現(xiàn)象，包括慢性炎 癥與抑郁癥“共病”，艾滋病與癡呆癥“共病”的現(xiàn)象等。其中免yi系統(tǒng)的 細(xì)胞因子以及趨化因子是導(dǎo)致該“共病”現(xiàn)象的重要活性分子，發(fā)揮對(duì)認(rèn) 知功能相關(guān)ji病如阿爾茨海默病，以及情緒障礙相關(guān)ji病如焦慮癥、抑郁 癥等ji病的重要調(diào)節(jié)作用。

聯(lián)體結(jié)合模型（Parabiosis)通過血管吻合術(shù)將兩只小鼠腹部縫合在一 起，使兩只小鼠共用一套血液循環(huán)系統(tǒng)。近年來，該模型被廣泛應(yīng)用于衰老領(lǐng)域的研究，是研究免yi分子對(duì)中qu神經(jīng)系統(tǒng)功能影響的重要模型。2011 年斯坦福大學(xué)Tony Wyss-Coray教授課題組為研究免yi微環(huán)境對(duì)機(jī)體衰老 的影響，采用聯(lián)體結(jié)合模型，篩選出6個(gè)系統(tǒng)因子（Systemic factor)在這 一過程中發(fā)揮重要作用，包括 CCL2 (MCP-1)、CCLll(Eotaxin)、CCL12 (MCP-5)、CCL19 (MIP-3p)、p2M(p2 microglobulin)、觸珠蛋白（Haptoglobin)。 這六個(gè)系統(tǒng)因子中，CCL2及CCL12對(duì)中qu神經(jīng)系統(tǒng)的功能的調(diào)節(jié)作用己 有較多報(bào)道，CCL2水平升高與認(rèn)知功能損傷程度呈正相關(guān)，CCL12與低氧 誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥關(guān)系密切。該團(tuán)隊(duì)隨后研究表明，CCL11、p2M可抑制小鼠 海馬區(qū)的神經(jīng)發(fā)生，導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降；側(cè)腦室注射CCL11中和 抗體可顯著改善CCL11對(duì)小鼠海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生的抑制作用，恢復(fù)小鼠空間 學(xué)習(xí)記憶能力，而敲除P2M基因亦可改善上述損傷。

趨化因子CCL19是在聯(lián)體結(jié)合模型基礎(chǔ)上篩選出的6個(gè)系統(tǒng)因子之 一。它屬于趨化因子CC家族，其受體為CCR7。在免yi系統(tǒng)中，CCL19 主要由中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌，其受體主要表達(dá)在T淋ba細(xì)胞、B 淋ba細(xì)胞、DC細(xì)胞表面。CCL19通過與CCR7受體結(jié)合趨化T淋ba細(xì)胞、 B淋ba細(xì)胞、DC細(xì)胞迀移至病灶區(qū)域發(fā)揮作用。此外，CCL19/CCR7軸亦 對(duì)T淋ba細(xì)胞的歸巢及存活發(fā)揮重要作用。近年來研究表明，大腦的星形 膠質(zhì)細(xì)胞以及腦血管內(nèi)皮細(xì)胞皆可分泌趨化因子CCL19，在中qu神經(jīng)系統(tǒng) 炎癥時(shí)，趨化免yi細(xì)胞進(jìn)入中qu神經(jīng)系統(tǒng)，到達(dá)病灶區(qū)域。中qu神經(jīng)系統(tǒng) 炎癥反應(yīng)亦伴隨著血漿中CCL19表達(dá)水平的異常，例如多發(fā)性硬化癥、腦 缺血性損傷、神經(jīng)炎癥ji病的患者，其血液和腦脊液中趨化因子CCL19的 表達(dá)水平皆異常升高。CCL19受體CCR7可表達(dá)于海馬、胼胝體區(qū)域的星 形膠質(zhì)細(xì)胞，然而其對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能的影響尚不清楚。CCR7基因敲除 的小鼠表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力的損傷，以及抑郁及焦慮樣情緒障礙。以上研 究提示趨化因子CCL19/CCR7對(duì)中qu神經(jīng)系統(tǒng)的作用不可忽視。情緒和認(rèn) 知是*為重要的兩類腦上等神經(jīng)精神功能，但是，目前報(bào)道趨化因子CCL19 對(duì)情緒以及認(rèn)知功能的影響尚不明確。

本課題以正常小鼠以及長(zhǎng)期不可預(yù)期性慢性應(yīng)激模型小鼠為研究對(duì) 象，研究趨化因子CCL19對(duì)小鼠認(rèn)知樣行為以及情緒樣行為的影響。并從 免yi系統(tǒng)功能和神經(jīng)系統(tǒng)功能兩個(gè)方面，研究趨化因子CCL19對(duì)認(rèn)知或情 緒樣行為影響的機(jī)制。

**部分趨化因子CCL19對(duì)正常小鼠認(rèn)知及情緒樣行為的影響 1.趨化因子CCL19對(duì)正常小鼠認(rèn)知樣行為的影響

選取2-3月齡C57BL/6小鼠，分別側(cè)腦室單次注射CCL19 (0.05 jig)以及隔天腹腔注射CCL19 (10pg/kg)，注射共12次歷時(shí)35天。通過六臂

水迷宮實(shí)驗(yàn)，觀察CCL19對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響；通過新物體識(shí) 別實(shí)驗(yàn)，觀察CCL19對(duì)小鼠物體識(shí)別記憶能力的影響。結(jié)果表明，趨化因子CCL19單次側(cè)腦室注射和腹腔注射12次，均對(duì)小鼠在六臂水迷宮實(shí)驗(yàn) 中的錯(cuò)誤數(shù)，新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中物體辨識(shí)指數(shù)無顯著影響，提示趨化因子 CCL19對(duì)小鼠的認(rèn)知樣行為無顯著影響。趨化因子CCL19對(duì)正常小鼠情緒樣行為的影響

采用上述給yao方式，通過高架0型迷宮實(shí)驗(yàn)和糖水消耗實(shí)驗(yàn)，觀察趨 化因子CCL19對(duì)小鼠焦慮及抑郁樣情緒的影響。結(jié)果表明，趨化因子CCL19 顯著增加了小鼠的糖水消耗率，減少了小鼠在高架0型迷宮中開放臂的停 留時(shí)間。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，趨化因子CCL19可能對(duì)小鼠的焦慮及抑郁樣 行為有明顯影響。趨化因子CCL19、CCL21中和抗體對(duì)小鼠焦慮及抑郁樣行為的影響

趨化因子CCL21是趨化因子CCL19的共受體因子，可以與CCR7結(jié)合 發(fā)揮對(duì)免yi細(xì)胞的趨化作用。CCL21對(duì)焦慮及抑郁樣行為的作用亦不明確。 因此，本部分實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步確認(rèn)CCL19及CCL21對(duì)焦慮及抑郁樣行為的 影響，并采用CCL19及CCL21中和抗體研究CCL19及CCL21對(duì)情緒反應(yīng) 的作用。

選用2-3月齡C57BL/6小鼠，分為五組，分別為正常組(腹腔注射PBS)， CCL19組，CCL21組，CCL19中和抗體組，CCL21中和抗體組。隔天腹腔 注射CCL19、CCL21 (均為10 |ig/kg)，注射共12次歷時(shí)35天。第30天 時(shí)，分別側(cè)腦室注射CCL19、CCL21 (均為0.05|ig)中和抗體及同型對(duì)照 抗體（正常組及CCL19、CCL21處理組注射同型對(duì)照抗體0.05|ig)。第36 天進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。通過高架十字迷宮以及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠的焦慮樣行 為，通過糖水消耗實(shí)驗(yàn)以及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠的抑郁樣行為。結(jié)果表 明，各處理組小鼠的自主活動(dòng)性均無顯著性差異。CCL19腹腔注射顯著增 加小鼠的糖水消耗率，降低小鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間，對(duì)小鼠在 高架十字迷宮中的開放臂停留時(shí)間以及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的中間區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間無顯 著影響。提示CCL19對(duì)小鼠抑郁樣行為有顯著影響，對(duì)小鼠焦慮樣行為無 明顯影響。CCL21腹腔注射顯著增加小鼠糖水消耗率，對(duì)小鼠在強(qiáng)迫游泳 實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的中間區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間及高架十字迷宮的開放 臂停留時(shí)間無顯著影響。提示CCL21對(duì)小鼠焦慮及抑郁樣行為均無明顯影 響。

側(cè)腦室注射趨化因子CCL19以及CCL21中和抗體后觀察小鼠的抑郁和 焦慮樣行為，結(jié)果表明小鼠在上述各行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)與同型對(duì)照抗體注射組小鼠表現(xiàn)無顯著差異，提示側(cè)腦室注射CCL19、CCL21中和抗體對(duì) CCL19及CCL21的情緒相關(guān)作用無顯著影響。

第二部分趨化因子CCL19對(duì)長(zhǎng)期不可預(yù)期性慢性應(yīng)激小鼠抑郁及焦慮樣 行為的影響

在確定CCL19對(duì)正常小鼠的抑郁樣行為有顯著影響的基礎(chǔ)上，采用長(zhǎng) 期不可預(yù)期性慢性應(yīng)激（CUMS)模型，評(píng)價(jià)趨化因子CCL19對(duì)CUMS模型小鼠焦慮樣及抑郁樣行為的影響。實(shí)驗(yàn)分五組，分別為正常組（腹腔注 射PBS)，CUMS模型組（腹腔注射PBS)，陽(yáng)**氟西汀給藥組（10mg/kg)， CCL19 組（10|ig/kg)，CCL19 與氟西汀合用組（10|ig/kg+10mg/kg)。隔天 腹腔注射CCL19,注射共12次歷時(shí)35天。第25天至第35天，每天腹腔 注射氟西汀，給藥共10次。造模持續(xù)35天，于第36天進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

釆用自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)趨化因子CCL19對(duì)CUMS模型小鼠的自主活動(dòng) 性的影響。結(jié)果表明，CUMS造模顯著降低小鼠體重，氟西汀及趨化因子CCL19腹腔注射可以在造模后期（第22天至第24天）緩解小鼠體重的下 降。各處理組小鼠的自主活動(dòng)性均無顯著性差異。